Elektroforez, bir çözeltide asılı taneciklerin, elektrik alanı etkisiyle ayrılmasıdır.
Arne Tiselius tarafından geliştirilmiş olan elektroforezden, özellikle tıpta ve biyokimyada, kandaki çeşitli protein ve lipitlerin ayrılması, tanınması ve miktarının ölçülmesinde yararlanılır. Ayrıca elektroforezden sanayide yaygın biçimde yararlanılmaktadır.
Elektroforez için DNA’nın hazırlanması
Elektroforezden önce, numunenin viskozitesini arttırmak için DNA numunesine bir boya eklenir, bu da numunenin kuyularda yüzmesini önler, böylece numunenin migrasyonu jel boyunca görülebilir.
Birinci jel kuyusuna bir DNA markörü (DNA boyutu standardı veya merdiveni olarak da bilinir) yüklenir. Göstergedeki parçalar belirli bir uzunluğa sahiptir, bu nedenle numunelerdeki parçaların boyutunu yaklaşık olarak belirlemeye yardımcı olmak için kullanılabilirler.
Hazırlanan DNA örnekleri daha sonra jelin kalan kuyularına pipetlenir.
Bu yapıldıktan sonra elektroforez tankının üzerine kapak takılır ve jelin yönünün ve pozitif ve negatif elektrotların doğru olduğundan emin oluruz (DNA’nın jelden pozitif uca göç etmesini isteriz).
Parçaları sökün
Negatif yüklü DNA’yı jel boyunca jelin pozitif tarafına taşımak için elektrik akımı açılır.
Daha kısa DNA uzunlukları, daha uzun uzunluklardan daha hızlı hareket eder, bu nedenle bir akış çalıştırırken daha fazla hareket edin.
DNA’nın jel içinde göç ettiği mesafe, renk tamponu geçişi izlenerek görsel olarak değerlendirilebilir.
Elektrik akımı, DNA parçalarının jel içinde onları ayıracak kadar uzun süre hareket etmesini sağlayacak kadar parlak kalır, ancak jelin ucunu terk edecek kadar uzun sürmez.
Poliakrilamid jellerle yapılan Elektroforez örnekteki bile şenlerin daha iyi ayrışmasına yol açar çünkü ayırım hem moleküler elekleme hem de elektroforetik harekete dayanır.
Poliakrikamid jeller akrilamid ve çapraz bağlayıcı N, N’metilen-bis akrilamidin serbest radikal polimerizasyonu ile hazırlanır. Kimyasal polimerizasyon bir başlatıcı-katalizör (amonyum persülfatTEMED) sistemi tarafından kontrol edilir. Fotokimyasal polimerizasyon, UV ışığı altında riboflavin tarafından gerçekleştirilir.
• Proteinlerin ayrılması için kullanılan jeller genelde %7,5 poliakrilamid içerir. Bu jeller 10.000-1000,000 Da moleküller için kullanılabilir ama en iyi çözünme 30,000- 300,000 Da arasında elde edilir. • Bir jelin ayrıştırma gücü ve molekül boyutu aralığı akrilamid ve bis akrilamid konsantrasyonuna bağlıdır.İki maddenin polimerizasyonu ile jelde porlar oluşur. • Dü şük konsantrasyonda daha büyük porlar olu şur ve yüksek molekül a ğırlıklı biyolojik moleküllerin analizi yapılabilir.Yüksek konsantrasyonlarda ise küçük porlar olu şur ve dü şük molekül a ğırlıklı moleküllerin ayırılması yapılır. • Poliakrilamid jel elektroforezi tüp veya düzlemsel(slab) biçimde hazırlanmış jellerde gerçekle ştirilir.Tabaka jeller aynı anda çok sayıda örne ğin destek ortamında analiz edilebilmesine imkan verdi ği için kolonlara göre daha geni ş çapta kullanılırlar. • Poliakrilamid jel birbirinden belli uzaklıkta (0,5-2,0 mm)tutulan iki cam tabaka arasında ve genelde 8-10 cm ya da 10-10 cm boyutunda hazırlanır.DNA dizileme çalışmalarında daha çok 20-40 cm boyutunda hazırlanır. • Polimerizasyon sırasında jelin üst kısmına yerle ştirilen plastik bir tarak jelde küçük kuyucukların olu şumunu sa ğlar .Polimerizasyondan sonra tarak çıkarılır,kuyucuklar tuzları ve polimerize olmamış akrilamidi yok etmek üzere tamponla yıkanır.Jel kaseti iki tampon arasına yerle ştirilir;kuyucuklara örnek ler konulur ve akım geçirilir. • Elektroforez bitiminde görüntüleme için jel uygun boya ile boyanır. PAGE de geliştirilen çeşitli teknikler (SDSPAGE gibi) tekniğin çok yönlü kullanılabilirliğini arttırmıştır. Agaroz Jel Elektroforezi Page daha çok proteinlerin ve küçük (350.000 Da yani 500bç’e kadar) DNA parçalarının ayırımı ve analizi için kullanışlıdır. Poliakrilamid jeldeki küçük por boyutları büyük DNA molekülü parçalarının ayırımı için uygun de ğildir.200- 50,000 bç boyutları arasındaki DNA ve RNA moleküllerini tanımlamakta kullanılan standart yöntem agaroz elektroforezidir. Agaroz bir alg türünden elde edilir.jel elektroforez tanponuna koyulmu ş agarozun yüksek sıcaklıkta çözündürülmesi ile hazırlanır. Kaynatılmış agaroz çözeltisi 50 dereceye kadar so ğutularak jel tepsilerine dökülür.ayrımı yapılacak örnek taraklarla olu şturulmu ş kuyucuklara yüklenir ve elektriksel alanda yürütülerek ayrımı yapılır. Jel uygun şekilde hazırlanırken ya da örnekler yüklenip elektriksel olarak ayrıldıktan sonra boyanır ve örneklerin görüntülenmesi gerçekleştirilir. Nükleik asitlerin agaroz jeldeki hareketleri agaroz konsantrasyonu ile nükleik asit moleküllerinin boyutları ve şeklinden etkülenir.Nükleik asitlerin ayırımı için en etkin agaroz konsantrasyonları %0,3-2,0 dir. Agaroz jel elektroforezi ile özellikle de ğişik kaynaklı DNA ın izole edildikleri veya enzim kesim ürünlerinin molekül a ğırlıkları ve miktarları belirlenebilir.Aynı zamanda proteinlerin yüklerine göre ayrılmasında da kullanılmaktadır. Değişken Alanlı (Pulsed Field) Jel Elektroforezi
• Yaklaşık 1 megabazdan daha büyük doğrusal çift iplikli DNA molekülleri agaroz jelde aynı hızda göç eder.Bunun nedeni jelin por büyüklüğünün doğrusal DNA nın jelde göç edebilmesi için yeterli olmamasıdır.Por büyüklüğü,konsantrasyonu %0,1 olan agaroz kullanılarak arttırılabilir. • Bu durumda jel çok kırılgan ve dayanıksız olacaktır.Bu problem 1984 te geliştirilen ve 5 Mb boyutundaki DNA fragmentlerini de ayırabilen “pulse field” jel elektroforezi tekniği ile ortadan kaldırılmıştır. • Bu yöntemde jele vuru şlu, dalgalı ve dikey elektrik alanları uygulanır. DNA molekülü ne kadar büyükse tekrar yönlenmesi o kadar uzun zaman alır. Bu şekilde büyüklüklerine göre ayrılırlar. • Sonuçta küçük moleküller elektriksel alan de ğişikliklerine daha çabuk uyum sa ğladıkları için daha hızlı hareket ederler. • Bu sistemde dikey elektrodların yanında farklı konfigürasyonlarda elektrodlar da kullanılmaktadır. • Bu yöntemle kromozomları jelde ayrı ayrı görebilmek mümkündür.
İşte bu işlemi Diyarbakır Adli Tıp Kurumu başaraamamış.
GELELİM PSA MESELESİNE. OTOPSİDE PSA BULUNMASI NARİN GÜRAN İÇİN NE
ANLAMA GELİYOR?
PSA testi nedir?
Prostat Spesifik Antijen(PSA) erkeklerde bulunan bir organ olan prostatta üretilen, meninin kıvamını düzenleyen bir enzimdir. Üretilen PSA’nın çok az bir kısmı kanda dolaşmaktadır. Prostatın iyi huylu büyümesi, prostat enfeksiyonları ve prostat kanseri gibi hastalıklarda PSA değişen miktarlarda kana geçmektedir. Kandaki PSA seviyesi ve bu seviyedeki değişim prostat hastalıklarının niteliği ile ilgili fikir verebilir.
* Prostat Spesifik Antijen(PSA) erkeklerde bulunan bir organ olan prostatta üretilen, meninin kıvamını düzenleyen bir enzimdir.
Narin'in üzerinde ve kıyafetlerinde bulunan PSA sperm ile temas ettiği anlamına gelir. Ya kendisi bir tacize maruz kalmıştır, ya da sperm olan bir yere yatırılmış ve böylece temas etmiştir.
Kommentare